论文题目：TestisformationinXXindividualsresultingfromnovelpathogenicvariantsinWilms’tumor1(WT1)gene|PNAS（肾肿瘤1(WT1)新致病变异体引起XX个体睾丸形成的研究）

01长出睾丸的女婴

Alice（化名）是一个出生在巴西的小女孩，在她1岁时，医生发现她的生殖系统出现了异常：Alice的子宫只有半个，体内存在睾丸组织，包括睾丸支持细胞和曲细精管。

在她10岁时，Alice体内的雌激素水平远低于雄性激素，而且似乎将一直维持在较低的水平。但她的父母并非近亲结婚，对她的外周血淋巴细胞的分析也显示，她体内的染色体数目是正常的，而性染色体为XX。

Alice所患的疾病属于“性别发育异常”（Differencesinsexualdevelopment，简称DSD）。平均每2500~4000人中，会出现一位DSD患者。

研究人员最开始一度认为Alice和大部分患者一样，患病的原因是本应该存于在Y染色体上的SRY基因，因为染色体交叉互换转移到了X染色体上。

而SRY基因对于开启男性生殖系统的发育具有关键作用，这一基因的转移也是导致女性患DSD的主要原因。

但检测结果却显示，Alice的基因组上并不存在SRY基因易位。因此，研究人员搜索了Alice基因组中其他和这一疾病相关的突变，最终找到了一个可疑的基因。

2018年，圣保罗大学的研究人员将这一研究结果发表于《临床遗传学》（ClinicalGenetics），证实Alice的患病原因罕见地与一个存在于常染色体上的癌症相关基因——WT1基因的突变有关。

02结果

所有患有TDSD/OTDSD的个体均为XX，具有不同程度的病毒。患者3出现XXTDSD，其外生殖器范围从典型的男性习惯性到模棱两可。

病人4呈XX型OTDSD。患者5a和5b分别为XXOTDSD和Meacham综合征伴XY性腺发育不全的同胞对。患者6具有典型的男性习惯性，表现为XX型TDSD。

患者7为先天性膈疝，外生殖器阳性，怀疑XXOTDSD。患者5a和5b的性腺组织学(患者7的肾脏超声检查是可用的。

WT1基因ZF4的致病变异与XXTDSD/OTDSD和XYMeacham综合征有关。

我们从78个不相关的XXTDSD/OTD个体(8.97%)中鉴定出7个家族，携带5个不同的WT1变异体([例1]；*15[患者2]；[患者5a，5b]；Lys491Glu[病人6]；*17[患者7]；在家庭受影响的XY同胞出现Meacham综合征(病人5b)。

所有变异体都聚集在脊椎动物物种高度保守的区域，该区域编码蛋白质的ZF4。没有WT1在400多个已知的可育个体(内部对照)中发现了变异体，公共数据库(exac数据库)中也没有变异体(exac数据库)。Http://和gnomAD数据库Https://)。

在我们的队列中观察到与XXDSD相关的LOF和非同义变体的频率的Fisher‘s精确检验(两尾)，而在我们的队列中与罕见的(较小的等位频率[MAF]0.01%)LOF和非同义变体的LOF和非同义变体相比WT1来自对照个体的基因，显示出这些基因的高度富集。

WT1患者队列中的变体(×10−4)。在六个家庭中，继承的方式是重新确定的，而在剩下的一个病例(病人6)中，这是未知的，因为父母的DNA无法进行研究。与对照个体中非同义/LOF变异体的频率相比(0/5Http:///denovo-db)，DSD队列对于denovo变体(P=4.1×10−6)。

此外，所有家族都是不相关的，来自地理上不同的地区，不包括罕见变异体的方正效应。所有XX名儿童SRY-阴性，外显子数据分析没有发现任何其他可能的致病变异，在已知的性别决定/DSD基因。

ClinVar(Https:///clinvar涉及WT1ZF4的致病变种(，变异ID：543123；[x2]，变异ID：578607；，变异ID：655847；，变异ID：664113)与WT1致病变种的典型临床特征(Denys-Drash综合征、Wilms肿瘤、变异症、生殖器异常、精神发育综合征、Frasier综合征)有关。

在我们的研究和提交给ClinVar数据库的患者中存在致病变异体，并且在公共数据库中没有类似的变化，这突出了WT1的ZF4的功能重要性。

Arg495Gly改变了蛋白质的生物活性

In蛋白模型预测变异体对WT1的ZF4结构稳定性有严重的有害影响。本文利用Arg495Gly变异作为概念证明，研究了WT1基因ZF4突变的功能后果，并通过体外和原位检测探讨了其可能的发病机制。

用瞬时转染法检测WT1蛋白在人胚肾HEK2T细胞中的亚细胞定位。我们观察到突变体和WT蛋白都有很强的核定位。据报道，ZF4可以稳定ZF2和ZF3的DNA结合。

因此，我们通过电泳迁移率转移试验(EMSA)研究了突变蛋白与WT1靶共识序列结合的能力，发现突变蛋白保持了dna结合活性。

Arg495Gly变异体可能是由于卵巢内睾丸特异性通路的不适当激活所致，直接激活睾丸基因或间接干扰正常抑制睾丸形成的通路。用报告法检测瞬时转染的HEK2T细胞，显示睾丸特异性增强子的活性显著增加。

SOX9(乐购)与辅助因子GATA4/FOG2和NR5A1。Arg495Gly还显示出卵巢特异性激活的剂量依赖性减少。FOXL2启动子。以前有人认为WT1和FOXL2蛋白可能相互作用，我们发现突变的WT1蛋白与FOXL2蛋白有类似野生型的结合。

将瞬时转染人颗粒Kgn-1细胞系，可使与支持细胞形成相关的内源性转录产物(SOX9,NR5A1,DMRT1)，而内源性颗粒细胞转录本的表达水平(FOXLβ连环素,FST)保持不变。

我们观察到内源性的上调。SOX9转染Kgn-1细胞后，ZF4(*和)表达受到影响。内源性水平FOXL2保持不变。

ZF3()的一个变异体在一对XX对患有肾脏疾病的同卵双生子中被报道，但没有发现病毒感染的证据。值得注意的是，SOX9该变异体转染后表达未上调，与临床表型一致。

03讨论

β-catenin在人和小鼠卵巢发育过程中起重要作用。Rspo/wnt维持β-catenin信号通路不仅支持或促进卵巢通路，而且抑制SOX9的表达和相通路。

在体外，我们观察到zf4变体不仅增加了相关的激活SOX9增强子，但也显示与β-catenin蛋白结合，而WT蛋白没有.值得注意的是，ZF3()中有一个变异体，它与肾脏疾病有关，但在XX个体中与DSD无关，与β-catenin蛋白的相互作用水平较低，可与WTWT相媲美.通过改变WT1的相互作用能力，并明显干扰β-catenin的关键亲卵巢因子和抗睾丸因子，ZF4变异体可能导致SOX9表达上调。

基于这些数据，我们提出了一种解释携带WT1ZF4变异体的XX个体睾丸形成的机制。突变体WT1与β-catenin蛋白的相互作用导致β-catenin的固存，从而对卵巢前通路的激活产生负面影响和/或导致SOX9的抑制。

因此，在XX染色体背景下，睾丸信号级联被激活。然而，WT1的生物学是高度复杂的，多个异构体表现出明显的亚核定位，在转录水平和转录后水平上具有不同的调节特性。不能排除突变体WT1可能通过RNA和染色质修饰等其他机制在XX性腺中诱导睾丸的形成。

总之，虽然WT1在两性性腺发育中具有复杂的早期作用，但与WT1的其他变体相比，我们认为在WT1的ZF4结构域中发现的变异可能导致在XX性腺胚胎发育过程中对雌性途径的直接或间接抑制和激活。因此，这些突变是XXSRY阴性(O)TDSD的一个相对常见的原因。